Cách chẩn đoán thường xuyên nhất là chẩn đoán lâm sàng, được thực hiện trên cơ sở triệu chứng và nơi ở của bệnh nhân trước khi bị ốm. Các đợt bệnh nhẹ chỉ có thể được xác định về mặt vi rút. Vì các cơn sốt vàng nhẹ có thể góp phần đáng kể cho sự bùng phát của khu vực, mọi trường hợp nghi ngờ sốt vàng (có triệu chứng sốt, đau, buồn nôn và nôn từ 6 đến 10 ngày sau khi rời khỏi khu vực bị ảnh hưởng) được điều trị một cách nghiêm túc.Nếu nghi ngờ có sốt vàng, vi rút không thể được xác nhận cho đến sáu đến 10 ngày sau khi bị ốm. Có thể nhận được sự xác nhận trực tiếp bằng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược, nơi bộ gen của virut được khuếch đại. Một phương pháp tiếp cận trực tiếp khác là sự cô lập của virus và sự phát triển của nó trong nuôi cấy tế bào sử dụng huyết tương; việc này có thể mất từ ​​một đến bốn tuần.Theo huyết thanh học, một xét nghiệm miễn dịch hấp thụ enzyme trong giai đoạn cấp tính của bệnh sử dụng IgM đặc hiệu chống sốt vàng hoặc tăng IgG đặc hiệu (so với mẫu sớm hơn) có thể xác nhận sốt vàng da. Cùng với các triệu chứng lâm sàng, phát hiện IgM hoặc tăng gấp bốn lần IgG-titer được xem là dấu hiệu đầy đủ cho sốt vàng da. Vì các xét nghiệm này có thể phản ứng chéo với các flavivirus khác, như virus dengue, những phương pháp gián tiếp này không thể kết luận chứng minh nhiễm sốt vàng.Sinh thiết gan có thể xác minh viêm và hoại tử tế bào gan và phát hiện kháng nguyên virus. Do xu hướng chảy máu của bệnh nhân sốt vàng, sinh thiết chỉ được khuyến cáo sau khi giết mổ để xác nhận nguyên nhân gây tử vong.Trong chẩn đoán phân biệt, các bệnh nhiễm trùng sốt vàng phải được phân biệt với các bệnh sốt khác như bệnh sốt rét. Các bệnh sốt xuất huyết khác như virut Ebola, virus Lassa, virus Marburg, và vi rút Junin phải được loại trừ như nguyên nhân.